Diego de Almagro nació en en la villa manchega de Almagro, España, lugar de donde tomó su apellido por haber sido hijo ilegítimo de Juan de Montenegro y Elvira Gutiérrez. Fue criado por Sancha López del Peral hasta sus cuatro años cuando regresa a Almagro bajo la tutela de su tío Hernán Gutiérrez. A los se fuga ante la dureza de su tío y acude a su madre, quien angustiada le buscó un pedazo de pan y unas monedas, y le dijo «Toma, hijo, y no me des más presión, y vete, y ayúdate de Dios en tu aventura». Se dirigió a Sevilla donde se convirtió en criado de Don Luis de Polanco, gracias a quien logra embarcarse hacia el Nuevo Mundo, después de haber acuchillado a otro criado y ser solicitado por la justicia.
Almagro arribó al Nuevo Mundo el en la expedición de Pedro Arias de Ávila desembarcado en la ciudad de Santa María la Antigua del Darién (en el actual Panamá) donde se encontraban otros futuros conquistadores. Tomó parte en las incursiones, fundaciones y conquistas en los alrededores del golfo de Panamá y tuvo un hijo con una india de la región, Diego de Almagro el Mozo. En , junto al conquistador Francisco Pizarro, iniciaron la conquista del territorio de los incas ocupando Cuzco en . Almagro llegó a ser gobernador de una mitad del Perú, mientras que Pizarro era gobernador de la otra mitad, pero al mismo tiempo era virrey de toda la colonia, por lo que pronto se convirtieron en rivales.
En el rey Carlos I otórgó a Diego de Almagro la gobernación de Nueva Toledo, al sur de Perú, y el título de adelantado de las tierras más allá del lago Titicaca.
Almagro entonces organizó en una expedición para la conquista de los territorios al sur con unos 500 españoles, unos 100 esclavos y miles de indios yanaconas para el transporte de armas y víveres. Esto fue luego de recibir noticias de los incas sobre la abundancia de oro en la región, pero era falso, los incas planeaban una rebelión y buscaban que los españoles se alejaran del Perú. La expedición viajó más de 2.500 km a través de los Andes y el altiplano boliviano donde perdió muchos hombres. En inició la exploración de los nuevos territorios (actual Chile) pero nunca encontró oro y sus encuentros con los nativos fueron extremadamente violentos. En se vieron forzados a regresar a Cuzco, Perú.
Muerte
A su regreso al Perú, Almagro tomó la ciudad de Cuzco por considerarla dentro de su territorio, pero desencadenó en una guerra civil con las fuerzas de Pizarro. Las fuerzas de Almagro vencieron en la Batalla de Abancay el y tomaron como prisioneros a Hernando y Gonzalo Pizarro. Pero en ambas fuerzas volvieron a enfrentarse en la Batalla de las Salinas y los almagristas fueron derrotados.
Diego de Almagro fue despojado de su título de gobernador, condenado a muerte y ejecutado por Hernando Pizarro en la Plaza Mayor de Cuzco el .